Prosjektnummer
901868
DNA-vaksine rettet mot spytt- og frontalfilamentproteiner (SaliFilaVax)
En effektiv vaksine mot lakselus vil kunne begrense dagens bruk av
mekaniske og biologiske behandlingsmetoder som i dag gir store og
uholdbare velferdsproblemer i oppdrettsnæringen. Veien frem til
en slik vaksine er imidlertid vanskelig, og det er få vaksiner mot
parasitter som har nådd kommersialisering. De første lusevaksinene
som har vært prøvd ut har typisk vært komponent-vaksiner med
både intracellulære og ekstracellulære lakselusproteiner som antigen, formulert som tradisjonelle vaksiner i oljeadjuvans og
injisert intraperitonalt. De mest lovende vaksinekandidatene for
slike komponentvaksiner har vært uttrykt i lusens tarm. Men da
lusens fordøyelsesenzymer kan se ut til å degraderer antistoffer
ganske så raskt etter lusen har inntatt et måltid, kan man ha et
større potensiale til å lykkes med vaksineantigen som virker i
grensesnittet mellom lusen og laksen.
Universitetet i Bergen (UiB) har derfor lenge hatt fokus på å øke kunnskapen rundt vert–parasitt-interaksjonen mellom laks og lakselus, for slik å kunne skape innovasjon innen vaksinestrategier mot lakselus. Det er i prosjektet “Samspill mellom lakselus og laks (ModuLus)” (FHF-901564) og foregående prosjekter finanseriert av Norges forskningsråd (SFI SLRC) og EU (ParaFishControl) identifisert og karakterisert en rekke gener uttrykt av lusens spyttkjertler, og funnet at noen av disse virker immundempende på laksen. Lakselusens spyttkjertelproteiner kan dermed ha et stort potensial som vaksinekandidater, og dette er det jobbet med i et annet prosjekt, “DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)” (FHF-901760), der det er prøvd å implementere disse proteinene i en DNA-vaksine. Men i de innledende eksperimentene har man imidlertid oppnådd en lav antistoffrespons mot disse immundempende proteinene. Dette er litt som forventet, da det vil være lite hensiktsmessig for en lus å sekrere proteiner som i seg selv har en høy immunogenisitet. Det er dermed høyst sannsynlig at flere av disse proteinene tenkt implementert i lusevaksinen må modifiseres for å få til en tilstrekkelig god antistoffproduksjon.
Forskerne vil også inkludere andre vaksineantigen som virker i grensesnittet mellom lus og laks, som frontalfilamentproteiner. Frontalfilamentet knytter lakselusen tett til laksens hud gjennom hele chalimusfasen, og er dermed et egnet vaksineantigen. Men proteinene som selve filamentet er bygget opp av er ukjent, og må dermed identifiseres før de kan bli anvendt i en vaksine.
Universitetet i Bergen (UiB) har derfor lenge hatt fokus på å øke kunnskapen rundt vert–parasitt-interaksjonen mellom laks og lakselus, for slik å kunne skape innovasjon innen vaksinestrategier mot lakselus. Det er i prosjektet “Samspill mellom lakselus og laks (ModuLus)” (FHF-901564) og foregående prosjekter finanseriert av Norges forskningsråd (SFI SLRC) og EU (ParaFishControl) identifisert og karakterisert en rekke gener uttrykt av lusens spyttkjertler, og funnet at noen av disse virker immundempende på laksen. Lakselusens spyttkjertelproteiner kan dermed ha et stort potensial som vaksinekandidater, og dette er det jobbet med i et annet prosjekt, “DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)” (FHF-901760), der det er prøvd å implementere disse proteinene i en DNA-vaksine. Men i de innledende eksperimentene har man imidlertid oppnådd en lav antistoffrespons mot disse immundempende proteinene. Dette er litt som forventet, da det vil være lite hensiktsmessig for en lus å sekrere proteiner som i seg selv har en høy immunogenisitet. Det er dermed høyst sannsynlig at flere av disse proteinene tenkt implementert i lusevaksinen må modifiseres for å få til en tilstrekkelig god antistoffproduksjon.
Forskerne vil også inkludere andre vaksineantigen som virker i grensesnittet mellom lus og laks, som frontalfilamentproteiner. Frontalfilamentet knytter lakselusen tett til laksens hud gjennom hele chalimusfasen, og er dermed et egnet vaksineantigen. Men proteinene som selve filamentet er bygget opp av er ukjent, og må dermed identifiseres før de kan bli anvendt i en vaksine.
Å supplere det allerede pågående
prosjektet “DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)” (FHF-901760) for å ytterligere øke sannsynligheten for å kunne
lage en vaksine som virker i grensesnittet mellom lakselus og laks.
Prosjektet kan frembringe nye, lovende vaksinekandidater ikke
bare for lakselus, men også skottelusen og andre lusearter som C.
rogercresseyi, og tilføre ny vaksineteknologi som kan anvendes
ikke bare mot lus, men også andre sykdommer som bakterielle
infeksjoner. Prosjektet har derfor et stort potensial til å påvirke
dagens laksenæring positivt, både i og utenfor Norges grenser.
I Norge representerer lakselus i dag oppdrettsnæringens hovedproblem, der lusen gir en rekke sykdoms- og velferdsutfordringer som følge av et intensivt lusebehandlingsregime, og er til hinder for videre vekst i næringen. En fungerende vaksine mot lus har et potensiale til å redusere kostnadene knyttet til lusebehandling betydelig og kan muliggjøre videre vekst i næringen. En slik vaksine vil også lette de store fiskehelse- og velferdsutfordringene knyttet til dagens metoder for lusebekjempelse, og muliggjøre en pensjonering av rensefisk.
I Norge representerer lakselus i dag oppdrettsnæringens hovedproblem, der lusen gir en rekke sykdoms- og velferdsutfordringer som følge av et intensivt lusebehandlingsregime, og er til hinder for videre vekst i næringen. En fungerende vaksine mot lus har et potensiale til å redusere kostnadene knyttet til lusebehandling betydelig og kan muliggjøre videre vekst i næringen. En slik vaksine vil også lette de store fiskehelse- og velferdsutfordringene knyttet til dagens metoder for lusebekjempelse, og muliggjøre en pensjonering av rensefisk.
Prosjektet er inndelt i tre arbeidspakker (AP-er). All
prosjektaktivitet vil bli utført av UiB.
AP1: Øke immunogenisiteten til lakselusens spyttkjertelproteiner
I denne arbeidspakken vil det ses nærmere på å øke immunogenisiteten til spyttkjertelproteinene, og kunnskap herifra vil implementeres i prosjektet “DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)” (FHF-901760). Det vil brukes et spyttkjertelprotein som man vet gir en lav immunrespons ved DNA-vaksinering, og uttrykke dette som fusjonsprotein med forskjellige modifikasjoner som er tenkt å øke antistoffproduksjonen mot dette antigenet. Konstruktene vil bli optimalisert basert på kunnskap utarbeidet i SaliVax, og injiseres i 30–40 g laks med den metoden funnet best i SaliVax. Den spesifikke antistoffresponsen vil bli analysert 600 døgngrader etter injeksjon med en etablert ELISA-metode.
1.1: Flagellin som adjuvant
Flagellin er et protein som utgjør en bakteries flagellum, og er et såkalt patogen-assosiert molekylært mønster (PAMP) som gjenkjennes av mønstergjenkjenningsreseptoren toll-liknende reseptor 5 (TLR5). Vi vil teste denne i en DNA-vaksine, for å se om en økt inflammasjon til stikkstedet kan øke antistoffproduksjonen.
1.2: Økt APC-opptak av antigenet
Her vil man forsøke å øke presentasjonen av vaksineantigenet til celler som kan hjelpe med å indusere en sterkere antistoffrespons (T hjelper celler). Dette vil gjøres ved å koble antigenet til komponenter som øker opptaket av proteinet i profesjonelle antigen presenterende celler som makrofager, B-celler og dendrittiske celler.
1.3 Antigenstørrelse
Mange spyttkjertelproteiner er relativt små proteiner, noe som kan være årsaken til den lave antistoffresponsen da det er antatt at større proteiner kan være bedre til å indusere immunresponser enn små proteiner. I dette delmålet vil størrelsen på antigenet økes for å teste om det er den lave molekylmassen til spyttkjertelproteinene som gir den lave immunogenisiteten.
Milepæl 1: Bestemmelse av egnet modifikasjon(er) for bruk i videre uttesting av lusevaksiner i SaliVax.
AP2: Frontalfilamentproteiner som DNA-vaksinekandidater
I AP2 vil det forsøkes å identifisere og karakterisere proteiner som utgjør en del av frontalfilamentet til både lakselus og skottelus, og se om man kan indusere en antistoffrespons mot aktuelle filamentantigen.
2.1: Identifikasjon av frontalfilamentproteiner i skottelus
For å indentifisere skottelusens frontalfilamentproteiner vil transkriptomet til skotteluskopepoditter analyseres. Videre vil aktuelle kandidater bli screenet med RNA-interferens, og gener som gir en endret filamentfenotype ved knock-down vil bli analysert med in situ hybridisering for å bekrefte hvilket vev/kjertler de uttrykkes i. Identifiserte gener vil bli fullsekvensert.
2.2: Identifikasjon av lakselusens frontalfilamentproteiner
Videre vil det forsøkes å identifisere ortologe frontalfilamentgener i lakselus, ved å bruke skottelusens frontalfilamentproteiner som agn. Også her anvendes RNA-sekvensering for å hjelpe med dette arbeidet. Aktuelle gen vil bli bekreftet å være uttrykt i filamentkjertlene samt funksjon som filamentproteiner slik som beskrevet for skottelus. Aktuelle gen vil bli fullsekvensert for å kunne implementeres i en DNA vaksine.
2.3: Uttesting av frontalfilamentenes immunogenisitet
Her vil det lages DNA-konstrukt med frontalfilamentantigener, og deres evne til å indusere en antistoffrespons i laksen ved injeksjon testes. UiB er i ferd med å teste ut forskjellige plasmiddesign, injeksjonsmetoder og molekylære adjuvanser i SaliVax, og vil anvende designet utarbeidet i SaliVax også med filamentvaksinen. Fisk ca 30–40 g vil bli pit-tagget og injisert med DNA-plasmid, og spesifikke antistoffer vil bli målt i blod, 600 døgn grader etter injeksjon. Hvis immunogenisiteten til frontalfilamentproteinene ser ut til å være lav, vil kunnskap opparbeidet i AP1 bli implementert her også.
Milepæl 2: Bestemmelse av egnet antigenkombinasjon som induserer adekvate antistoffkonsentrasjoner for videre uttesting i smitteforsøk.
AP3: Kan frontalfilamentproteinene indusere en beskyttende respons ved DNA-vaksinering?
I AP3 vil det undersøkes om det er mulig å oppnå en beskyttende immunrespons mot lakselus etter vaksinering, etter å ha optimalisert den mest lovende vaksinen fra SaliVax-prosjektet med kunnskap opparbeidet i AP1 i kombinasjon med filamentantigen identifisert i AP2. Hvis vaksinert fisk har lavere smitte, vil dette danne grunnlaget for en videreutvikling av konseptet. Laks vil bli pit-tagget og vaksinert som beskrevet før ved ca 30–40 g, og holdt i ferskvann (12 °C) i 600 døgngrader før smoltifiseringen blir initiert for å sikre at en adekvat antistoffrespons er utviklet forut for denne påkjenningen.
Fisken vil bli smoltifisert og holdt seks uker i saltvann (34,5 ppt) før smitteforsøk med kopepoditter (60 kopepoditter/fisk) blir utført, også dette ved 12 °C. I tillegg til å registrere antall lus på uvaksinert og vaksinert fisk, vil konsentrasjonen av spesifikke antistoffer i slim og blod samt den lokale immunresponsen mot lusene bli målt ved chalimus II-stadiet 13 dager etter smitte.
3.1 Kan frontalfilamentantigener alene indusere en beskyttende respons?
Her vil det gjøres et smitteforsøk med lakselus etter vaksinering med filamentantigener, for å undersøke om dette er tilstrekkelig for å redusere eller hindre etablering av lakseluskopepoditter.
3.2 Gir en kombinasjonsvaksine med både frontalfilament- og spyttkjertelantigener bedre beskyttelse?
Her vil det gjøres et smitteforsøk med lakselus etter vaksinering med en DNA-vaksine som kombinerer frontalfilament og spyttkjertelantigen (utarbeidet i SaliVax), for å undersøke om det er mulig å redusere etablering av lakseluskopepoditter ytterligere. Det vil også testes om man kan ekskludere enkelte antigen i en slik kombinasjonsvaksine, der man har ekskludert de antigenene som gir dårligst antistoffrespons, eventuelt som er lavest uttrykt i lusen og muligens ikke er like viktig i vert–parasittresponsen. Dette fordi et enklere vaksinedesign vil gi en vaksine som er billigere og lettere å masseprodusere.
Milepæl 3: Vurdering av frontalfilamentproteinenes potensiale som vaksineantigen i en DNA-vaksine mot lakselus, alene og i kombinasjon med spyttkjertelproteiner.
AP1: Øke immunogenisiteten til lakselusens spyttkjertelproteiner
I denne arbeidspakken vil det ses nærmere på å øke immunogenisiteten til spyttkjertelproteinene, og kunnskap herifra vil implementeres i prosjektet “DNA-vaksine rettet mot lakselusspytt (SaliVax)” (FHF-901760). Det vil brukes et spyttkjertelprotein som man vet gir en lav immunrespons ved DNA-vaksinering, og uttrykke dette som fusjonsprotein med forskjellige modifikasjoner som er tenkt å øke antistoffproduksjonen mot dette antigenet. Konstruktene vil bli optimalisert basert på kunnskap utarbeidet i SaliVax, og injiseres i 30–40 g laks med den metoden funnet best i SaliVax. Den spesifikke antistoffresponsen vil bli analysert 600 døgngrader etter injeksjon med en etablert ELISA-metode.
1.1: Flagellin som adjuvant
Flagellin er et protein som utgjør en bakteries flagellum, og er et såkalt patogen-assosiert molekylært mønster (PAMP) som gjenkjennes av mønstergjenkjenningsreseptoren toll-liknende reseptor 5 (TLR5). Vi vil teste denne i en DNA-vaksine, for å se om en økt inflammasjon til stikkstedet kan øke antistoffproduksjonen.
1.2: Økt APC-opptak av antigenet
Her vil man forsøke å øke presentasjonen av vaksineantigenet til celler som kan hjelpe med å indusere en sterkere antistoffrespons (T hjelper celler). Dette vil gjøres ved å koble antigenet til komponenter som øker opptaket av proteinet i profesjonelle antigen presenterende celler som makrofager, B-celler og dendrittiske celler.
1.3 Antigenstørrelse
Mange spyttkjertelproteiner er relativt små proteiner, noe som kan være årsaken til den lave antistoffresponsen da det er antatt at større proteiner kan være bedre til å indusere immunresponser enn små proteiner. I dette delmålet vil størrelsen på antigenet økes for å teste om det er den lave molekylmassen til spyttkjertelproteinene som gir den lave immunogenisiteten.
Milepæl 1: Bestemmelse av egnet modifikasjon(er) for bruk i videre uttesting av lusevaksiner i SaliVax.
AP2: Frontalfilamentproteiner som DNA-vaksinekandidater
I AP2 vil det forsøkes å identifisere og karakterisere proteiner som utgjør en del av frontalfilamentet til både lakselus og skottelus, og se om man kan indusere en antistoffrespons mot aktuelle filamentantigen.
2.1: Identifikasjon av frontalfilamentproteiner i skottelus
For å indentifisere skottelusens frontalfilamentproteiner vil transkriptomet til skotteluskopepoditter analyseres. Videre vil aktuelle kandidater bli screenet med RNA-interferens, og gener som gir en endret filamentfenotype ved knock-down vil bli analysert med in situ hybridisering for å bekrefte hvilket vev/kjertler de uttrykkes i. Identifiserte gener vil bli fullsekvensert.
2.2: Identifikasjon av lakselusens frontalfilamentproteiner
Videre vil det forsøkes å identifisere ortologe frontalfilamentgener i lakselus, ved å bruke skottelusens frontalfilamentproteiner som agn. Også her anvendes RNA-sekvensering for å hjelpe med dette arbeidet. Aktuelle gen vil bli bekreftet å være uttrykt i filamentkjertlene samt funksjon som filamentproteiner slik som beskrevet for skottelus. Aktuelle gen vil bli fullsekvensert for å kunne implementeres i en DNA vaksine.
2.3: Uttesting av frontalfilamentenes immunogenisitet
Her vil det lages DNA-konstrukt med frontalfilamentantigener, og deres evne til å indusere en antistoffrespons i laksen ved injeksjon testes. UiB er i ferd med å teste ut forskjellige plasmiddesign, injeksjonsmetoder og molekylære adjuvanser i SaliVax, og vil anvende designet utarbeidet i SaliVax også med filamentvaksinen. Fisk ca 30–40 g vil bli pit-tagget og injisert med DNA-plasmid, og spesifikke antistoffer vil bli målt i blod, 600 døgn grader etter injeksjon. Hvis immunogenisiteten til frontalfilamentproteinene ser ut til å være lav, vil kunnskap opparbeidet i AP1 bli implementert her også.
Milepæl 2: Bestemmelse av egnet antigenkombinasjon som induserer adekvate antistoffkonsentrasjoner for videre uttesting i smitteforsøk.
AP3: Kan frontalfilamentproteinene indusere en beskyttende respons ved DNA-vaksinering?
I AP3 vil det undersøkes om det er mulig å oppnå en beskyttende immunrespons mot lakselus etter vaksinering, etter å ha optimalisert den mest lovende vaksinen fra SaliVax-prosjektet med kunnskap opparbeidet i AP1 i kombinasjon med filamentantigen identifisert i AP2. Hvis vaksinert fisk har lavere smitte, vil dette danne grunnlaget for en videreutvikling av konseptet. Laks vil bli pit-tagget og vaksinert som beskrevet før ved ca 30–40 g, og holdt i ferskvann (12 °C) i 600 døgngrader før smoltifiseringen blir initiert for å sikre at en adekvat antistoffrespons er utviklet forut for denne påkjenningen.
Fisken vil bli smoltifisert og holdt seks uker i saltvann (34,5 ppt) før smitteforsøk med kopepoditter (60 kopepoditter/fisk) blir utført, også dette ved 12 °C. I tillegg til å registrere antall lus på uvaksinert og vaksinert fisk, vil konsentrasjonen av spesifikke antistoffer i slim og blod samt den lokale immunresponsen mot lusene bli målt ved chalimus II-stadiet 13 dager etter smitte.
3.1 Kan frontalfilamentantigener alene indusere en beskyttende respons?
Her vil det gjøres et smitteforsøk med lakselus etter vaksinering med filamentantigener, for å undersøke om dette er tilstrekkelig for å redusere eller hindre etablering av lakseluskopepoditter.
3.2 Gir en kombinasjonsvaksine med både frontalfilament- og spyttkjertelantigener bedre beskyttelse?
Her vil det gjøres et smitteforsøk med lakselus etter vaksinering med en DNA-vaksine som kombinerer frontalfilament og spyttkjertelantigen (utarbeidet i SaliVax), for å undersøke om det er mulig å redusere etablering av lakseluskopepoditter ytterligere. Det vil også testes om man kan ekskludere enkelte antigen i en slik kombinasjonsvaksine, der man har ekskludert de antigenene som gir dårligst antistoffrespons, eventuelt som er lavest uttrykt i lusen og muligens ikke er like viktig i vert–parasittresponsen. Dette fordi et enklere vaksinedesign vil gi en vaksine som er billigere og lettere å masseprodusere.
Milepæl 3: Vurdering av frontalfilamentproteinenes potensiale som vaksineantigen i en DNA-vaksine mot lakselus, alene og i kombinasjon med spyttkjertelproteiner.
Prosjektet har som mål å øke den grunnleggende forståelsen for om en DNA-test-vaksine rettet mot lakselusens spyttkjertel- og frontalfilamentproteiner gir en beskyttende immunrespons som kan redusere lusepåslag. Den viktigste leveransen i prosjektet vil derfor være en test-vaksine mot lus som kan gi grunnlag for en fremtidig kommersiell DNA-basert lusevaksine.
Prosjektleder og prosjektgruppen vil vektlegge å sikre åpen, effektiv og god formidling av forskningsresultatene. Deler av prosjektet vil frembringe generell kunnskap om lusens frontalfilament, men også generelt om vaksinedesign. Dette vil formidles gjennom vitenskapelige artikler publisert i internasjonale tidsskrifter med åpen tilgjengelighet (open access). Viktige resultater vil også bli publisert på forskergruppens nettsider her. Noen resultater vil imidlertid være av spesiell interesse for næringen. Disse vil bli formidlet på nasjonale konferanser som FHFs Lusekonferansen, Frisk Fisk og Havbrukskonferansen, samt som populærvitenskapelige artikler i bransjetidsskrifter som kyst.no og iLaks. Man vil også presentere resultater på internasjonale konferanser som SeaLice2024. Hvis prosjektet lykkes i å identifisere en mulig lakselusvaksine vil denne bli patentert, og tatt videre til kontakter i selskap som jobber med fiskevaksiner.
Prosjektleder og prosjektgruppen vil vektlegge å sikre åpen, effektiv og god formidling av forskningsresultatene. Deler av prosjektet vil frembringe generell kunnskap om lusens frontalfilament, men også generelt om vaksinedesign. Dette vil formidles gjennom vitenskapelige artikler publisert i internasjonale tidsskrifter med åpen tilgjengelighet (open access). Viktige resultater vil også bli publisert på forskergruppens nettsider her. Noen resultater vil imidlertid være av spesiell interesse for næringen. Disse vil bli formidlet på nasjonale konferanser som FHFs Lusekonferansen, Frisk Fisk og Havbrukskonferansen, samt som populærvitenskapelige artikler i bransjetidsskrifter som kyst.no og iLaks. Man vil også presentere resultater på internasjonale konferanser som SeaLice2024. Hvis prosjektet lykkes i å identifisere en mulig lakselusvaksine vil denne bli patentert, og tatt videre til kontakter i selskap som jobber med fiskevaksiner.