Prosjektnummer
901434
Tenacibaculum spp. som årsak til atypisk vintersår på norsk oppdrettslaks
Ny kunnskap om risikofaktorer for utvikling av tenacibakulose, viktige bidrag til å kunne iverksette bedre overvåkning og biosikkerhetstiltak mot sårsykdom i laksenæringen
• Tenacibaculum spp. bekreftes som etiologisk agens i de undersøkte utbruddene, basert på konsistent klinikk, histopatologi og bakteriologi kombinert med tett kobling mellom bakterieceller og observerte patologiske funn.
• T. finnmarkense, særlig genomovar finnmarkense, er sterkt assosiert med alvorlige kranialskader hos nylig sjøutsatt atlantisk laksesmolt.
• En stor gruppe tilnærmet klonale isolater av T. finnmarkense genomovar finnmarkense ble funnet i alle de undersøkte anlegg fra Vestland til Finnmark, og en ny art T. piscium (NCBI taksonomi ID 1458515) ble offisielt beskrevet og navngitt ifølge “Bacteriological Code”.
• Toksisiteten til Tenacibaculum spp. er forbundet med en ekstracellular faktor som er varme-sensitiv, sannsynligvis knyttet til proteinoppbygging. T. finnmarkense gv. finnmarkense var mest toksisk av de undersøkte isolatene.
• Proteomikk studier indikerer forskjeller i proteinuttrykk mellom T. finnmarkense gv. finnmarkense og gv. ulcerans.
• Det er ingen indikasjon på at rognkjeks representerer en alvorlig trussel med tanke på overføring av tenacibaculose til oppdrettslaks holdt i samme merd.
• Temperatur ved sjøsetting har betydning for utvikling av tenacibaculose, med betydelig raskere utvikling i fiskegrupper satt ut ved sjøtemperatur lavere enn 5 ˚C sammenlignet med høyere temperaturer.
• T. finnmarkense, særlig genomovar finnmarkense, er sterkt assosiert med alvorlige kranialskader hos nylig sjøutsatt atlantisk laksesmolt.
• En stor gruppe tilnærmet klonale isolater av T. finnmarkense genomovar finnmarkense ble funnet i alle de undersøkte anlegg fra Vestland til Finnmark, og en ny art T. piscium (NCBI taksonomi ID 1458515) ble offisielt beskrevet og navngitt ifølge “Bacteriological Code”.
• Toksisiteten til Tenacibaculum spp. er forbundet med en ekstracellular faktor som er varme-sensitiv, sannsynligvis knyttet til proteinoppbygging. T. finnmarkense gv. finnmarkense var mest toksisk av de undersøkte isolatene.
• Proteomikk studier indikerer forskjeller i proteinuttrykk mellom T. finnmarkense gv. finnmarkense og gv. ulcerans.
• Det er ingen indikasjon på at rognkjeks representerer en alvorlig trussel med tanke på overføring av tenacibaculose til oppdrettslaks holdt i samme merd.
• Temperatur ved sjøsetting har betydning for utvikling av tenacibaculose, med betydelig raskere utvikling i fiskegrupper satt ut ved sjøtemperatur lavere enn 5 ˚C sammenlignet med høyere temperaturer.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Bakgrunnen for prosjektet var et økende antall Tenacibaculum-relaterte atypiske utbrudd av vintersår/ tenacibaculose med alvorlige hode- og finneskader på fisken, som var avvikende fra det vanlige kliniske bildet hos fisk med vintersår forårsaket av bakterien Moritella viscosa. Prosjektet ble igangsatt for å identifisere og beskrive hvilke varianter av Tenacibaculum som var involvert, identifisere mulige underliggende produksjonsforhold og miljøfaktorer som bidro til sykdomsutbrudd, samt karakterisere toksinproduksjon og toksisk aktivitet med tanke på mulig vaksineutvikling.
Molekylær- og produksjonsrelatert epidemiologi
Mellom januar og mai 2018 ble det mottatt materiale fra 19 mistenkte tenacibaculose utbrudd fra Hordaland til Finnmark. Histopatologiske undersøkelser og dyrking viste at Tenacibaculum spp. dominerte i de observerte sårskadene. For å sammenligne og validere slektskapsanalyser gjort på basis av 2018-undersøkelsene, ble det også undersøkt Tenacibaculum isolater fra diagnostiske saker fra våren 2019. Helgenombaserte analyser bekreftet at T. finnmarkense genomovar (gv.) finnmarkense (genomvar = stammer som er ulike fylogenetisk, men like fenotypisk) dominerte i utbruddene fra begge år, med påvisning av en meget tett beslektet subgruppe av genomovaren. I løpet av prosjektet ble en hittil ubeskrevet Tenacibaculum sp. isolert fra laks med sår, offisielt navngitt som T. piscium. Videre ble T. finnmarkense offisielt navngitt og videre fordelt i gv. finnmarkense og ulcerans. Det ble undersøkt om rognkjeks representerer en mulig smittekilde for laks. Mens T. finnmarkense gv. finnmarkense påvist hos laks også ble påvist hos rognkjeks, tilhørte de fleste rognkjeks-isolater T. finnmarkense gv. ulcerans eller T. dicentrarchi. Slektskapsanalyse av norsk T. maritimum viste at flere genotyper eksisterer i Norge, og at man bør være forberedt på mulig økende problemer med denne arten i fremtiden (f.eks. knyttet til global oppvarming av havet).
Innhentede produksjonsdata fra 19 mistenkte lokaliteter og 6 kontroll-lokaliteter fra de involverte oppdrettsselskapene viste at vanntemperatur ved utsett i sjø er en risikofaktor. Tid mellom utsett og utvikling av tenacibaculose var betydelig redusert for grupper satt ut ved sjøtemperaturer under 5 ˚C sammenlignet med utsett over 5 ˚C.
Forbedret diagnostikk
Tenacibaculum spp. er tidkrevende å identifisere med standard biokjemiske testing. Prosjektet utviklet MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desportion time of flight mass spectromy) som en presis og rask diagnostisk metode for identifikasjon av Tenacibaculum spp.
Toksinkarakterisering
Proteinutrykk i ulike Tenacibaculum stammer ble karakterisert og kvantifisert. Proteomikk-analyser identifiserte mange fellestrekk i proteinuttrykk mellom stammene, med et klart skille mellom Tenacibaculum finnmarkense gv. finnmarkense og gv. ulcerans. Videre arbeid med identifisering av de spesifikke proteinene pågår.
Ekstracellulære toksisitet
En in vitro modell for å måle toksisitet av cellefrie Tenacibaculum ekstracellulære produkter (ECP) ble utviklet. En nyetablert cellelinje fra hud hos atlantisk laks ble eksponert for fortynningsrekker av ECP, og toksisitet av ECP ble påvist med flere metoder. Det ble påvist forskjeller i toksisitet mellom ulike Tenacibaculum arter og genomovarer, med T. finnmarkense gv. finnmarkense som den mest toksiske. Varmebehandling av ECP fjernet den toksiske aktiviteten, noe som tyder på proteinoppbygging av den toksiske faktor. Tilsetning av antisera laget mot T. piscium og T. finnmarkense gv. ulcerans hadde ingen nøytraliseringseffekt på toksisk aktivitet.
Results achieved
Molekylær- og produksjonsrelatert epidemiologi
Mellom januar og mai 2018 ble det mottatt materiale fra 19 mistenkte tenacibaculose utbrudd fra Hordaland til Finnmark. Histopatologiske undersøkelser og dyrking viste at Tenacibaculum spp. dominerte i de observerte sårskadene. For å sammenligne og validere slektskapsanalyser gjort på basis av 2018-undersøkelsene, ble det også undersøkt Tenacibaculum isolater fra diagnostiske saker fra våren 2019. Helgenombaserte analyser bekreftet at T. finnmarkense genomovar (gv.) finnmarkense (genomvar = stammer som er ulike fylogenetisk, men like fenotypisk) dominerte i utbruddene fra begge år, med påvisning av en meget tett beslektet subgruppe av genomovaren. I løpet av prosjektet ble en hittil ubeskrevet Tenacibaculum sp. isolert fra laks med sår, offisielt navngitt som T. piscium. Videre ble T. finnmarkense offisielt navngitt og videre fordelt i gv. finnmarkense og ulcerans. Det ble undersøkt om rognkjeks representerer en mulig smittekilde for laks. Mens T. finnmarkense gv. finnmarkense påvist hos laks også ble påvist hos rognkjeks, tilhørte de fleste rognkjeks-isolater T. finnmarkense gv. ulcerans eller T. dicentrarchi. Slektskapsanalyse av norsk T. maritimum viste at flere genotyper eksisterer i Norge, og at man bør være forberedt på mulig økende problemer med denne arten i fremtiden (f.eks. knyttet til global oppvarming av havet).
Innhentede produksjonsdata fra 19 mistenkte lokaliteter og 6 kontroll-lokaliteter fra de involverte oppdrettsselskapene viste at vanntemperatur ved utsett i sjø er en risikofaktor. Tid mellom utsett og utvikling av tenacibaculose var betydelig redusert for grupper satt ut ved sjøtemperaturer under 5 ˚C sammenlignet med utsett over 5 ˚C.
Forbedret diagnostikk
Tenacibaculum spp. er tidkrevende å identifisere med standard biokjemiske testing. Prosjektet utviklet MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desportion time of flight mass spectromy) som en presis og rask diagnostisk metode for identifikasjon av Tenacibaculum spp.
Toksinkarakterisering
Proteinutrykk i ulike Tenacibaculum stammer ble karakterisert og kvantifisert. Proteomikk-analyser identifiserte mange fellestrekk i proteinuttrykk mellom stammene, med et klart skille mellom Tenacibaculum finnmarkense gv. finnmarkense og gv. ulcerans. Videre arbeid med identifisering av de spesifikke proteinene pågår.
Ekstracellulære toksisitet
En in vitro modell for å måle toksisitet av cellefrie Tenacibaculum ekstracellulære produkter (ECP) ble utviklet. En nyetablert cellelinje fra hud hos atlantisk laks ble eksponert for fortynningsrekker av ECP, og toksisitet av ECP ble påvist med flere metoder. Det ble påvist forskjeller i toksisitet mellom ulike Tenacibaculum arter og genomovarer, med T. finnmarkense gv. finnmarkense som den mest toksiske. Varmebehandling av ECP fjernet den toksiske aktiviteten, noe som tyder på proteinoppbygging av den toksiske faktor. Tilsetning av antisera laget mot T. piscium og T. finnmarkense gv. ulcerans hadde ingen nøytraliseringseffekt på toksisk aktivitet.
Results achieved
Summary of results from the project's final report
The project was initiated against a background of increasing outbreaks of atypical winter-ulcer/ tenacibaculosis amongst sea-farmed Atlantic salmon. The aims of the project were to identify and describe the Tenacibaculum-variants involved, identify possible underlying production and environmental factors that contribute to outbreak of tenacibaculosis, characterise toxin production and toxic activity, with a view to possible vaccine development.
Molecular and production-related epidemiology
Between January and May 2018, samples were submitted from 19 suspected cases of tenacibaculosis. Histopathological investigations and culture identified Tenacibaculum spp. as the dominating contributor to the observed lesions. To compare and validate the phylogenetic analyses performed on 2018 isolates, a number of isolates retrieved during diagnostic investigations in 2019 were also investigated. Whole-genome based analyses conformed that T. finnmarkense genomovariant (gv.) finnmarkense dominated all outbreaks and that an extremely closely related cluster of isolates dominated further within this genomovar in both years. Tenacibaculum isolates retreived from lumpfish were also investigated with a view to establish whether this fish species represent a possible source of infection for salmon. While the same type of T. finnmarkense gv. finnmarkense dominating the disease situasjon in salmon was also identified in lumpfish, most lumpfish isolates belonged either to T. finnmarkense gv. ulcerans or T. dicentrarchi. Phylogenetic analysis of T. maritimum, revealed that several genotypes of this bacterium exist in Norway and that the industry should be prepared for a possible increase in the impact of this pathogenic species in future years (e.g. in association with global ocean warming).
Production data gathered from 19 affected farming localities and 6 control sites revealed that water temperature on sea-transfer appears to be a risk factor and period between sea-transfer and development of tenacibaculosis was considerably reduced for fish transferred to sea at temperatures of less than 5˚C compared to fish transferred to sea at temperatures of 5˚C or higher.
Improved diagnostics
Tenacibaculum spp. are time-consuming to identify using standard biochemical tests. The project developed MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desportion time of flight mass spectromy) as a precise and rapid diagnostic method for identification of Tenacibaculum spp.
Toxin characterisation
Protein expression was characterised and quantified in different Tenacibaculum strains. Proteomic analyses revealed expression of many proteins to be common for all studied genotypes but found clear differences between T. finnmarkense and non-T. finnmarkense strains. The work of identification of the specific proteins is ongoing.
Extracellular toxicity
An in vitro model for estimation of toxicity of cell-free Tenacibaculum extracellular products (ECP) was developed. A newly established Atlantic salmon skin cell-line was exposed to serial dilutions of ECP and toxicity of the ECP for the cell-cultures analysed using different methodologies. Differences in toxicity were identified between different Tenacibaculum species and genomovars, with T. finnmarkense gv. finnmarkense identified as the most toxic. Heat treatment of ECP neutralised the toxic activity of ECP, which indicates proteinaceous contruction of the toxic factor. Addition of antisera raised against T. piscium and T. finnmarkense gv. ulcerans had no neutralising effect on the toxic activity.
Vitenskapelig publisering
– Anne Berit Olsen, Bjørn Spilsberg, Hanne Nilsen, Karin Lagesen, Snorre Gulla, Ruben Avendan o-Herrera, Rute Irgang, Eric Duchaud, and Duncan J. Colquhoun, ‘Tenacibaculum piscium sp. nov., isolated from skin ulcers of sea-farmed fish, and description of Tenacibaculum finnmarkense sp. nov. with subdivision into genomovars finnmarkense and ulcerans, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology’, 70/12 (2020), 6079–90. doi.org/10.1099/ijsem.0.004501 (open access).
– Bjørn Spilsberg, Hanne K. Nilsen, Saraya Tavornpanich, Snorre Gulla, Mona Dverdal Jansen, Karin Lagesen, Duncan J. Colquhoun, and Anne-Berit Olsen, ‘Tenacibaculosis in Norwegian Atlantic salmon (Salmo salar) cage-farmed in cold seawater is primarily associated with Tenacibaculum finnmarkense genomovar finnmarkense’, Journal of Fish Diseases 13577 (2021), 1–12. doi.org/10.1111/jfd.13577 (open access).
I tillegg er 2–3 artikler under bearbeiding som vil legges her når disse er publisert.
Prosjektet har gitt verdifull kunnskap om atypisk vintersår hos laks hva angår årsakssammenhenger, etiologi, risikofaktorer og kunnskapsgrunnlag for vaksineutvikling, som samlet sett vil være viktige bidrag for å kunne iverksette bedre overvåkning og biosikkerhetstiltak mot sårsykdom i laksenæringen.
-
Populærformidling: Ny kunnskap om tenacibaculose hos laks
Norsk Fiskeoppdrett, s. 39. Nr 6-2022. Av Bjørn Spilsberg, Anne-Berit Olsen, Hilde Sindre, Snorre Gulla, Jan Haug Anonsen, Hanne Nilsen og Duncan Colquhoun.
-
Sluttrapport: Tenacibaculum spp. som årsak til atypisk vintersår i norsk oppdrettslaks
Veterinærinstituttet. Januar 2022. Av Duncan Colquhoun, Bjørn Spilsberg, Anne-Berit Olsen, Hanne Nilsen, Saraya Tavornpanich, Mona Dverdal Jansen, Hilde Sindre og Jan Anonsen (NORCE).
Tenacibakulose har forholdsvis nylig vokst frem som en alvorlig trussel for norsk oppdrettslaks. Det relative bidraget fra selve bakterien, produksjonsforhold og miljøfaktorer til utbrudd av tenacibakulose, er imidlertid ukjent. Det beskrevne prosjektet har blitt igangsatt for å identifisere risikofaktorer av betydning for utbrudd av tenacibakulose, identifisere og karakterisere toksiner som forårsaker kliniske symptomer, og for å teste om antistoffer mot toksinene kan beskytte mot sykdommen.
Hovedmål
Å øke kunnskapen om tenacibakulose i norsk oppdrettslaks.
Delmål
• Å utvikle en klinisk beskrivelse (definisjon) av sykdommen tenacibakulose i norsk oppdrettslaks.
• Å identifisere risikofaktorer for utbrudd av tenacibakulose.
• Å karakterisere toksinproduksjon i Tenacibaculum spp.
• Å teste “proof of principle” for bruk av toksiner som antigen i vaksiner.
Prosjektet vil ha verdi i form av identifikasjon av risikofaktorer for utvikling av tenacibakulose, som så kan muliggjøre igangsetting av tiltak for å unngå utbrudd. Toksinkarakterisering og vaksineringsforsøk basert på cellekulturer vil utgjøre et grunnlag for videre vaksineutvikling.
Prosjektets aktiviteter er delt inn i tre arbeidspakker:
Arbeidspakke 1
Denne hovedarbeidspakken angår det epidemiologiske studiet basert på produksjonsdata, spørreundersøkelser og genotyping av involverte bakterier. En mindre del av denne arbeidspakken vil, ved hjelp av histologisk teknikker, gi en klinisk beskrivelse/definisjon av sykdommen “tenacibakulose”, noe som til nå har vært manglende.
Arbeidspakke 2
Denne arbeidspakken vil beskrive og karakterisere ekstracellulær protein(toksin)produksjon i Tenacibaculum spp.
Arbeidspakke 3
Denne arbeidspakken vil undersøke muligheter for bruk av Tenacibaculum-toksiner som immunogene antigener i vaksiner. Arbeidet vil baseres på in vitro forsøk i cellekulturer.
Prosjektorganisering
Prosjektet ledes av Veterinærinstituttet. Med unntak av proteinkaratkteriseringen, som utføres av IRIS, vil alt arbeid foregå ved Veterinærinstituttet.
Resultatene skal presenteres på Havbrukskonferansen 2018, på Frisk Fisk-konferansen 2019, og på European Association of Fish Pathologists (EAFP)-konferansen 2019. Resultatene skal også presenteres på FHF-seminarer. Én populærvitenskapelig publikasjon og to vitenskapelige publikasjoner planlegges ved prosjektslutt.
-
Sluttrapport: Tenacibaculum spp. som årsak til atypisk vintersår i norsk oppdrettslaks
Veterinærinstituttet. Januar 2022. Av Duncan Colquhoun, Bjørn Spilsberg, Anne-Berit Olsen, Hanne Nilsen, Saraya Tavornpanich, Mona Dverdal Jansen, Hilde Sindre og Jan Anonsen (NORCE).