Prosjektnummer
901642
Rød laks – genetiske effekter
Ny kunnskap om faktorer som påvirker innfarging av pigment i laks
• Knock-out (KO)-eksperimenter med CRISPR/CAS9 bekrefter at genet bco1-like er det genet som i størst grad påvirker filetfarge hos laks.
• Analyser av genaktiviteten i KO-fiskene støtter hypotesen om at overgang til mer vegetabilske fett-kilder i fôret også påvirker astaxanthin-omsetningen.
• Gjentatt håndteringsstress og hypoksi i månedene før slakting førte ikke til tap av farge eller astaxanthin.
• Laks som var utsatt for gjentatt stress og hypoksi hadde lavere kroppsvekt, lavere kondisjonsfaktor og dårligere hud- og øyehelse sammenlignet med laks som ikke var håndtert.
• Analyser av genaktiviteten i KO-fiskene støtter hypotesen om at overgang til mer vegetabilske fett-kilder i fôret også påvirker astaxanthin-omsetningen.
• Gjentatt håndteringsstress og hypoksi i månedene før slakting førte ikke til tap av farge eller astaxanthin.
• Laks som var utsatt for gjentatt stress og hypoksi hadde lavere kroppsvekt, lavere kondisjonsfaktor og dårligere hud- og øyehelse sammenlignet med laks som ikke var håndtert.
Sammendrag av resultater fra prosjektets faglige sluttrapport (English summary further below)
Dårlig eller ujevn innfarging av pigment i laksefilet er en utfordring for norsk laksenæring. Økt tilsetning av pigment i fôret synes ikke å løse problemene. Tidligere studier har indikert at genetikk styrer så mye som 60 % av variasjonen i filetfarge, men også fôrsammensetning og stress i forbindelse med håndtering antas å kunne påvirke dette. Målsettingen med dette prosjektet var å 1) bruke knock-out (KO)-linjer av laks for å studere effekten av enkeltkandidatgener på innfarging og identifisere metabolske nettverk som er påvirket av disse genene; 2) bruke selekterte avlslinjer av laks (rød/blek) i et sjøvannsforsøk for å kvantifisere opptak av pigment og undersøke hvorvidt gjentatt eksponering for hypoksi/stress påvirker innfarging. Forsøkene bekreftet at genet bco1-like (beta-carotene oxygenase 1-like) trolig er det viktigste genet som styrer pigmentering. Genuttrykksanalyse avslørte også at astaxantin-metabolisme og underliggende synteseveier av gener er koblet til kolesterol biosyntese, vitamin D syntese og lipid metabolisme. Med tanke på at vegetabilske oljebaserte dietter påvirker gener som kontrollerer lipidmetabolisme, kan resultatene indikere at overgangen fra marint til vegetabilsk fôr også kan ha påvirket astaxanthin-metabolismen.
Sjøvannsforsøket viste ingen tap av astaxanthin eller filetfarge etter gjentatt trenging og hypoksi i forkant av utslakting. Denne observasjonen gjaldt både røde og bleke genetikk-linjer. Fiskegrupper utsatt for stress hadde for øvrig lavere kroppsvekt og kondisjonsfaktor sammenlignet med ustressede kontroller. Fisk fra stress-grupper hadde også redusert velferd jamfør økt skjelltap, blødninger og ugjennomsiktig øyelinse. Den praktiske betydningen av resultatene kan være å belyse at gjentatt hypoksi/stress har negativ påvirkning i produksjonssammenheng, som er uavhengig av pigmentering. Overlappende nettverk av gener som håndterer astaxanthin og lipidmetabolisme understreker også ulike fettkilder i fôret kan være viktig for å oppnå tilfredsstillende pigmentering.
Dårlig eller ujevn innfarging av pigment i laksefilet er en utfordring for norsk laksenæring. Økt tilsetning av pigment i fôret synes ikke å løse problemene. Tidligere studier har indikert at genetikk styrer så mye som 60 % av variasjonen i filetfarge, men også fôrsammensetning og stress i forbindelse med håndtering antas å kunne påvirke dette. Målsettingen med dette prosjektet var å 1) bruke knock-out (KO)-linjer av laks for å studere effekten av enkeltkandidatgener på innfarging og identifisere metabolske nettverk som er påvirket av disse genene; 2) bruke selekterte avlslinjer av laks (rød/blek) i et sjøvannsforsøk for å kvantifisere opptak av pigment og undersøke hvorvidt gjentatt eksponering for hypoksi/stress påvirker innfarging. Forsøkene bekreftet at genet bco1-like (beta-carotene oxygenase 1-like) trolig er det viktigste genet som styrer pigmentering. Genuttrykksanalyse avslørte også at astaxantin-metabolisme og underliggende synteseveier av gener er koblet til kolesterol biosyntese, vitamin D syntese og lipid metabolisme. Med tanke på at vegetabilske oljebaserte dietter påvirker gener som kontrollerer lipidmetabolisme, kan resultatene indikere at overgangen fra marint til vegetabilsk fôr også kan ha påvirket astaxanthin-metabolismen.
Sjøvannsforsøket viste ingen tap av astaxanthin eller filetfarge etter gjentatt trenging og hypoksi i forkant av utslakting. Denne observasjonen gjaldt både røde og bleke genetikk-linjer. Fiskegrupper utsatt for stress hadde for øvrig lavere kroppsvekt og kondisjonsfaktor sammenlignet med ustressede kontroller. Fisk fra stress-grupper hadde også redusert velferd jamfør økt skjelltap, blødninger og ugjennomsiktig øyelinse. Den praktiske betydningen av resultatene kan være å belyse at gjentatt hypoksi/stress har negativ påvirkning i produksjonssammenheng, som er uavhengig av pigmentering. Overlappende nettverk av gener som håndterer astaxanthin og lipidmetabolisme understreker også ulike fettkilder i fôret kan være viktig for å oppnå tilfredsstillende pigmentering.
Results achieved
Summary of results from the project's final report
Summary of results from the project's final report
Weak or uneven colour distribution in salmon fillet is a problem for the Norwegian aquaculture iindustry. Increasing the amount of pigments added to the feed does not seem to solve this problem. Previous studies have indicated that genetics controls as much as 60 per cent of the variation in fillet colour, but also the overall feed composition and stress during handling is believed to affect fillet colour. The aim of this project was to (i) use of knock out (KO) lines of salmon to investigate the effect of single candidate genes on pigmentation, and identify the metabolic networks affected by these genes and (ii) use selected lines of salmon (RED/PALE) in a seawater experiment to quantify uptake of pigment, and determine if repeated exposure of hypoxia/stress have an impact on pigmentation. Our experiments confirmed bco1-like as the most important gene for pigmentation. The gene expression analyses also revealed that astaxanthin metabolism and pathways of underlying genes are linked to cholesterol biosynthetic processes, vitamin D synthesis and lipid metabolism. Knowing that vegetable oil-based diet does affect genes controlling lipid metabolism, our results may indicate that the change from fish-based oils to vegetable oils also have affected the astaxanthin metabolism.
The seawater experiment showed no loss of astaxanthin or fillet colour after repeated crowding and hypoxia prior to harvesting. This observation was true for salmon being from either the RED or PALE genetic lines. However, the ‘stressed’ fish had lower body weight and lower condition factor compared to non-stressed controls. Fish in the ‘stress’ group did also show lower welfare determined by increased scale loss, bleedings and eye lens opacity. The practical use of these results might be to highlight the negative impact of repeated hypoxia/stress in a production setting, although not related to pigmentation. The ‘overlap’ of networks handling astaxanthin metabolism and lipid metabolism also underscore the importance of the different fat sources in the feed in achieving satisfying pigmentation.
Vitenskapelige publikasjoner / Scientific publications
The seawater experiment showed no loss of astaxanthin or fillet colour after repeated crowding and hypoxia prior to harvesting. This observation was true for salmon being from either the RED or PALE genetic lines. However, the ‘stressed’ fish had lower body weight and lower condition factor compared to non-stressed controls. Fish in the ‘stress’ group did also show lower welfare determined by increased scale loss, bleedings and eye lens opacity. The practical use of these results might be to highlight the negative impact of repeated hypoxia/stress in a production setting, although not related to pigmentation. The ‘overlap’ of networks handling astaxanthin metabolism and lipid metabolism also underscore the importance of the different fat sources in the feed in achieving satisfying pigmentation.
Vitenskapelige publikasjoner / Scientific publications
To manuskripter er under utarbeidelse og legges her når publisert.
Prosjektet har avdekket viktige molekylære mekanismer og gener som styrer innfarging av pigment i laksemuskel, gjennom fiskeforsøk med bruk av ulike genetiske linjer selektert for ulik grad av innfarging. Videre indikerer resultatene at gjentatt hypoksi/stress har negativ påvirkning i produksjonssammenheng, men at dette er uavhengig av pigmentering. Overlappende nettverk av gener som styrer astaxanthin og lipidmetabolisme belyser at ulike fettkilder i fôret kan være viktig for å oppnå tilfredsstillende pigmentering.
-
Master’s Thesis: Fish welfare and color of skin and fillets of Atlantic salmon from two genetic lines exposed to repeated hypoxia prior to harvesting
Norwegian University of Life Sciences, Department of Animal and Aquaculture Sciences. 2022. By Marte Røsvik.
-
Master’s Thesis: Phenotypic effects of knocking out the pigmentation related genes, abcg2, bco1, and bco1-like in Atlantic salmon
Norwegian University of Life Sciences, Faculty of Biosciences. 2022. By Brandi Nicole Kuhn.
-
Sluttrapport: Rød laks – genetiske effekter
Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). November 2022. Av Dag Inge Våge (NMBU), Turid Mørkøre (NMBU), Fabian Grammes (AquaGen) og Jacob Seilø Torgersen (AquaGen).
Blek og eller ujevn rødfarge i laksemuskel er i økende grad rapportert som et kvalitetsproblem for norsk oppdrettslaks. Pigmentnivået har vært jevnt avtakende de siste årene, og i 2020 er det oppdrettere som rapporterer om de laveste pigmentnivåene som er målt i norsk oppdrettslaks noensinne. Rødfargen kommer fra astaxanthin i fôret og det antas at endringer i råvaresammensetning, med økt innhold av ulike vegetabilske råvarer, forklarer noe av den reduserte innfargingen. Blek filetfarge og skjolding settes også i sammenheng med utfordrende driftsforhold med økt håndtering av fisken og stress. Laksen responderer på stress med å forbruke astaxanthin som antioksidant. For å løse pigmenteringsproblemet har fôrets innhold av astaxanthin blitt økt, men på grunn av lavt opptak over tarmen har ikke dette resultert i tilstrekkelig forbedret muskelinnfarging.
Flere slaktetester i regi av AquaGen viser at genetikk er avgjørende for god innfarging, med arvbarhet på 0,6. Dette betyr at 60 % av fargen styres av gener involvert i astaxanthinmetabolismen. Et samarbeid mellom AquaGen og CIGENE har identifisert tre quantitative trait locus (QTL)-er som kan øke mengden akkumulert astaxanthin i muskel med 2 mg/kg. Potensielle kausale gener testes nå ut ved hjelp av genredigering (CRISPR/CAS9) i prosjektet “Gene Editing to Innovate Norwegian Breeding Industries” (GeneInnovate) (Forskningsrådets prosjektnr. 281928). CRISPR-fisken gir prosjektgruppen en unik mulighet til å identifisere og studere mekanismene som er avgjørende for opptak og retensjon av astaxanthin. I tillegg har man en lakselinje som utelukkende er selektert for ekstra intens rødfarge som vil supplere forsøkene med de genredigerte fiskene. Det er den betydelige variasjonen i filetfarge som gjør fiskematerialet så velegnet for mekanismestudier m.h.t. astaxanthin opptak, transport og omsetning. Prosjektets fokus vil være på kartlegging av molekylære mekanismer som styrer opptak, transport og omsetning av astaxanthin i laks. Dette er grunnleggende kunnskap som også er nødvendig for å formulere et fôr som gir tilstrekkelig fargeintensitet og fargestabilitet i laksefileter.
Flere slaktetester i regi av AquaGen viser at genetikk er avgjørende for god innfarging, med arvbarhet på 0,6. Dette betyr at 60 % av fargen styres av gener involvert i astaxanthinmetabolismen. Et samarbeid mellom AquaGen og CIGENE har identifisert tre quantitative trait locus (QTL)-er som kan øke mengden akkumulert astaxanthin i muskel med 2 mg/kg. Potensielle kausale gener testes nå ut ved hjelp av genredigering (CRISPR/CAS9) i prosjektet “Gene Editing to Innovate Norwegian Breeding Industries” (GeneInnovate) (Forskningsrådets prosjektnr. 281928). CRISPR-fisken gir prosjektgruppen en unik mulighet til å identifisere og studere mekanismene som er avgjørende for opptak og retensjon av astaxanthin. I tillegg har man en lakselinje som utelukkende er selektert for ekstra intens rødfarge som vil supplere forsøkene med de genredigerte fiskene. Det er den betydelige variasjonen i filetfarge som gjør fiskematerialet så velegnet for mekanismestudier m.h.t. astaxanthin opptak, transport og omsetning. Prosjektets fokus vil være på kartlegging av molekylære mekanismer som styrer opptak, transport og omsetning av astaxanthin i laks. Dette er grunnleggende kunnskap som også er nødvendig for å formulere et fôr som gir tilstrekkelig fargeintensitet og fargestabilitet i laksefileter.
Hovedmål
Å sikre god innfarging av norsk oppdrettslaks ved å beskrive og forstå genetiske og molekylære flaksehalser.
Delmål
a) Å verifisere genetiske flaskehalseffekter
på astaxanthinopptak i tarmepitel ved bruk av tre etablerte genredigerte
linjer.
b) Å frembringe kvantitative data på opptak og degradering av astaxanthin i tarmepitel ved hjelp av to genetisk ulike linjer.
c) Å undersøke hvordan stress
påvirker omsetning av astaxanthin og om laks med høyt astaxanthininnhold er
bedre beskyttet mot stressrelaterte ujevnheter i filetfarge.
Problemer med blek rødfarge er kostnadskrevende og sammensatt og kan ikke løses med søkelys på en faktor alene. I dette prosjektet forventes det at
prosjektgruppens kompetanse innen genomikk, molekylære mekanismer/ biomolekylære interaksjoner, oppdrettsforhold, stressrespons og filetkvalitet til sammen vil bidra med økt kunnskap om opptak og retensjon av astaxanthin som kan fortelle hvordan det er mulig å sikre effektiv utnyttelse av pigmentet i fôret for å oppnå forutsigbar filetfarge som tilfredsstiller markedskravene.
Prosjektet vil bidra med nødvendig kunnskap til å forbedre det genetiske potensiale for innfarging, også når nye fôrmidler tas i bruk. Slik kan man sikre at fremtidens foreldrefisk gir avkom med stabil og effektiv avleiring av fôrets pigmenter.
Prosjektet vil forbedre forståelsen av astaxanthin-omsetning; hvilke gener er involvert og regulering (“molecular pathways” i astaxanthinmetabolismen). Dette er etterspurt kunnskap som kan benyttes av fôrindustrien for identifisering av fôrkomponenter som øker eller hemmer astaxanthinopptak, samt bedre forståelsen av samspill mellom kort-/langtidseffekt effekt av stress, fôr og genetikk.
Prosjektet vil forbedre forståelsen av astaxanthin-omsetning; hvilke gener er involvert og regulering (“molecular pathways” i astaxanthinmetabolismen). Dette er etterspurt kunnskap som kan benyttes av fôrindustrien for identifisering av fôrkomponenter som øker eller hemmer astaxanthinopptak, samt bedre forståelsen av samspill mellom kort-/langtidseffekt effekt av stress, fôr og genetikk.
Astaxanthindeponering i laksemuskel avhenger av samspillet mellom fiskens genetiske potensial for rødfarge, fôr og miljø. Dette prosjektet setter søkelys på den genetiske komponenten av problemet for å identifisere og tallfeste molekylære og cellulære mekanismer som motvirker/stimulerer innfarging. En vil også se på betydningen av stress og samspill med genetikk. Ved å benytte ulike lakselinjer har prosjektet unike verktøy for a) verifisere genetiske/molekylære mekanismer og flaskehalser, b) kvantifisere hvor mye astaxanthin som forsvinner mellom opptak i tarm og deponering i muskel, i to lakselinjer med ulikt potensial for rødfarge og c) kvantifisere effekten av stress på ujevnheter i rødfarge i to ulike lakselinjer, som over. Prosjektet bygger på en lakselinje som i snitt deponerer over 9 mg astaxanthin per kilo muskel i 5 kilos laks og tre ulike CRISPR/CAS9 knock-out-linjer. De sistnevnte stammer fra prosjektet GeneInnovate og representerer de to viktigste QTL-ene for farge.
• Ta ut vevsprøver av CRISPR KO-fisk, RNA-sekvensering og CRISPR KO-effektivitetsanalyser.
• Fiskeforsøk med genetiske linjer i ferskvann og saltvann.
• HPLC-analyser av astaxanthin, måling av filetfarge og kvalitet.
Kompetanse og infrastruktur
• Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap (IHA) har lang erfaring med kvalitetsmålinger av laks og analyser av pigment og filetfarge.
• CIGENE-miljøet er ledende innen genomikk på laksefisk med stor utstyrspark og etablerte metoder nødvendige for gjennomføring av prosjektet.
AquaGen
Ansvarsområde
Transkriptomanalyser og konfokalmikroskopi.
Milepeler og leveranser for arbeidspakker
Milepeler
A.1: Fôre opp bco1, bco1 like og abcg2 CRISPR KO linjene og kontrollfisk til ca. 60 g med fôr som inneholder 50 ppm astaxanthin.
A.1: Fôre opp bco1, bco1 like og abcg2 CRISPR KO linjene og kontrollfisk til ca. 60 g med fôr som inneholder 50 ppm astaxanthin.
A.2: Ta ut blod, tarm og lever fra all fisk og estimere individuell KO-effektivitet.
A.3: Analysere plasma, tarm og lever i kontrollfisk og KO-fisk ved hjelp av HPLC, histologi, konfokalmikroskopi og transkriptomanalyser (RNA-sekvensering).
Leveranser
i) Verifisere betydningen av genene bco1, bco1 like og abcg2 for opptak av astaxanthin i KO-laks.
ii) Kvantifisere astaxanthin opptak og degradering.
ii) Kvantifisere astaxanthin opptak og degradering.
iii) Etablere molekylære nettverk (molecular pathways) ved hjelp av transkriptomanalyser på tarm og lever.
Milepeler
B.1. Fôre opp laks fra en ekstra rød linje og kontroll linje frem til 60 g.
B.1. Fôre opp laks fra en ekstra rød linje og kontroll linje frem til 60 g.
B.2. Tallfeste astaxanthinopptak etter fôring med 50 ppm astaxanthin ved hjelp av HPLC-analyse av plasma.
B.3. Transkriptomanalyser på tarm og lever.
Leveranser
i) Kvantifisere genetiske effekter på astaxanthinopptak.
ii) Etablere molekylære sammenhenger (molecular pathways) ved hjelp avtranskriptomanalyser på tarm og lever.
Milepeler
Milepeler
C.1. Fôre opp smolt med ulik genetikk til 3–4 kg, fisk fra rød linje og kontrollfisk.
C.2. Stresse laks med hypoksi og kvantifisere effekten på fargestyrke og fargejevnhet (kort- og langtidseffekt).
Leveranser
i) Identifisere hvorvidt stress påvirker farge, fargejevnhet og avdekke samspillseffekter (genetikk, metabolisme).
Prosjektorganisering
NMBU – IHA / CIGENE
AnsvarsområdeNMBU – IHA / CIGENE
• Ta ut vevsprøver av CRISPR KO-fisk, RNA-sekvensering og CRISPR KO-effektivitetsanalyser.
• Fiskeforsøk med genetiske linjer i ferskvann og saltvann.
• HPLC-analyser av astaxanthin, måling av filetfarge og kvalitet.
Kompetanse og infrastruktur
• Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap (IHA) har lang erfaring med kvalitetsmålinger av laks og analyser av pigment og filetfarge.
• CIGENE-miljøet er ledende innen genomikk på laksefisk med stor utstyrspark og etablerte metoder nødvendige for gjennomføring av prosjektet.
AquaGen
Ansvarsområde
Transkriptomanalyser og konfokalmikroskopi.
Det tas sikte på å publisere to populærvitenskapelig artikler, årlig deltagelse på konferanser med presentasjoner og to vitenskapelige artikler.
-
Sluttrapport: Rød laks – genetiske effekter
Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). November 2022. Av Dag Inge Våge (NMBU), Turid Mørkøre (NMBU), Fabian Grammes (AquaGen) og Jacob Seilø Torgersen (AquaGen).
Medieomtale
Genetics to improve salmon pigmentation
https://hatcheryfm.com/
Projekte zur besseren Pigmentierung von Lachs
https://www.fischmagazin.de/
Two new projects on pigmentation in salmon
https://www.fis.com/
AquaGen forsker på rødfargen til laksen
https://aquatechcluster.no/
Laksekjøttet blir bleikere. Nå skal de finne ut hvorfor.
Tekfisk.no
Aquagen og NMBU skal finne ut hvorfor laksekjøttet blir bleikere
intrafish.no (passord)